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Combinando la neurociencia y la ingeniería química, investigadores de la Universidad de Stanford han desarrollado un proceso que hace al cerebro de ratón transparente. El cerebro postmortem permanece entero, con su complejidad tridimensional molecular y estructuras finas completamente intactas. El proceso, llamado CLARITY, marca el comienzo de una nueva era en las técnicas biológicas de imagen1 y promete cambiar fundamentalmente nuestra comprensión científica de los más importantes pero menos comprendidos de los órganos, el cerebro, y posiblemente otros órganos también. El proceso se describe en un artículo publicado en línea el 10 de abril en la revista Nature por el bioingeniero y psiquiatra Karl Deisseroth, MD, PhD, líder de un equipo multidisciplinario, incluyendo al estudiante postdoctoral Kwanghun Chung, PhD.

ratas
CLARITY comienza con una muestra de tejido postmortem. Una serie de tratamientos químicos permiten la eliminación de lípidos en la muestra, mientras que casi todas las proteínas y el contenido genético (DNA o RNA) se quedan en su lugar. El propósito de esto, es lograr la transparencia del tejido y por lo tanto susceptible de investigación microscópica detallada de sus partes funcionales constituyentes (que son predominantemente proteínas). Para lograr esto, la estructura de la proteína preexistente tiene que estar en una especie de “andamio” transparente, mientras se eliminan los componentes lipídicos. Este ‘andamio’ se compone de monómeros de hidrogel tales como acrilamida.Una vez completado este paso, los componentes de las proteínas y el contenido genético de las células del tejido diana se mantienen firmemente en su lugar, mientras que los componentes lipídicos son eliminados.1 Los lípidos son entonces retirados de 1-2 semanas de difusión pasiva en el detergente, o acelerados por métodos electroforéticos. A medida que pasan a través, propiedades lipofílicas del detergente le permiten recoger cualquier lípido encontrados en el camino. La gran mayoría de moléculas de lípidos no se ven afectados por este procedimiento, gracias al gel de acrilamida y las propiedades químicas de las moléculas implicadas. “Pensamos que si pudiéramos eliminar los lípidos de forma no destructiva, podríamos ser capaces de permitir el paso de la luz para penetrar profundamente en los tejidos, lo que permite no sólo de mágenes 3-D, pero también en 3-D de análisis molecular del cerebro intacto”, dijo Deisseroth para la gaceta de la Universidad de Stanford.

En esta etapa del proceso, la muestra ha sido totalmente preparada para la imagen. Se utilizan anticuerpos que se unen específicamente a una determinada sustancia diana. El contraste para la formación de imágenes puede venir de moléculas endógenas hechasfluorescentes, o a partir de las etiquetas en ácidos nucleicos (DNA o RNA), o de la inmunotinción. Estos anticuerpos marcados con etiquetas fluorescentes son la clave para la formación de imágenes con equipos de microscopía con focal estándar, de dos fotones, o formación de imágenes de hoja de luz. Estos métodos son adecuados para luego detectar la fluorescencia emitida a la escala de la localización de la proteína, lo que resulta al final muy detallado en imágenes tridimensionales, que este procedimiento produce.

tridimensional

“Vista tridimensional del hipocampo teñido, mostrando neuronas fluorescentes (verde), la conexión de las interneuronas (rojo) y la glía (azul)”

Cuando se acompaña con un anticuerpo o “etiquetado” molecular, CLARITY permite imágenes altamente detalladas de alguna proteína en especial, su estructura y el papel que desempeña en diferentes órganos, especialmente el cerebro. Con la preservación de la plena continuidad de las estructuras neuronales, este procedimiento no sólo permite el rastreo de las conexiones neuronales individuales a través de largas distancias a través del cerebro, sino que también proporciona una forma de reunir la información molecular que describe la función de una célula, lo que no es posible con otros métodos. Los investigadores pueden rastrear los circuitos neuronales a través de todo el cerebro o profundamente explorar los matices de cableado del circuito local. Pueden ver las relaciones entre las células e investigar estructuras subcelulares. Incluso pueden mirar las relaciones químicas de complejos de proteínas, ácidos nucleicos y neurotransmisores.

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